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【Inscopix】科学家验证食物选择偏好在大脑里的处理机制 ——Inscopix钙离子显微成像技术在外周神经系统研究中的应用

发布日期:2020-04-27  浏览次数:916

度过物资匮乏的年代,享受生活成了的主流,人类创造出出了极其丰富璀璨的美食文化,并在当下得到了异常繁荣的发展。我们有分辨五味的能力,但同一种味道,两个人分辨出来的感觉是一样的吗?答案是否定的。每个人因为各自特有的一些神经和生物感知上的细微差别,感知的味道是不完全相同的;并且我们对于食物的喜好的复杂度似乎是超越味觉的,同样都是甜的或辣的东西,我们的味觉却有完全不同、极为丰富的感知。

这些对食物选择的偏好在我们的大脑里有什么样的处理机制呢?

最近,里斯本Champalimaud研究中心Fernandes等科学家在《neuron》杂志上发表了一篇名为“Postingestive Modulation of Food Seeking Depends on Vagus-Mediated Dopamine Neuron Activity”的文章,科研人员使用了由格罗贝尔引进中国并始终为中国代理的inscopix nVoke2.0在体自由动物神经元成像设备对小鼠进行了大量实验和分析,尝试解密这个大脑处理机制。

科学家们通过实验验证小鼠食用蔗糖的摄食后反馈是否可以导致摄食行为,即是否可以诱导调控小鼠开启蔗糖开关,饥饿的小鼠在经过训练学会了通过按压开关如何选择获得蔗糖和三氯蔗糖(一种无热量的甜味剂)溶液(F1A)。科学家发现,最初小鼠对两种溶液的取食次数相似,但随着时间推移,对蔗糖的取食次数逐渐增加,说明蔗糖引起的摄食后反馈会促使小鼠更多的索取蔗糖。为了验证蔗糖的摄食后反馈不靠口感也足以驱动取食行为,科学家将小鼠植入了胃导管以进行蔗糖和三氯蔗糖的长期刺激。利用经过训练并随时剥夺小鼠开启开关以进行胃内注射食物,同时在口部摄取清水,观察到开启频率增高很多。小鼠控制开关可以在嘴边获得清水,并同时会往胃里注入蔗糖溶液,小鼠会加剧地开启开关。与之相反,如果胃里注入的是三氯蔗糖,则开启频率没有升高。在另一组小鼠中,相似的训练但同时控制2个开关,来选择往胃里注入蔗糖或三氯蔗糖,小鼠没有通过味觉感知也自行适应出了往胃里注入蔗糖溶液的偏好。说明小鼠能随机感觉出摄食动作和他们的摄食后结果的差别。为了验证这种偏好不是由甜味口感刺激驱动产生的,研究人员使用Trpm5 敲除小鼠,这种小鼠不能感受甜味。实验结果依然是偏好蔗糖而不是三氯蔗糖,证明了这些行为是由于受营养物质的取食后反馈诱导而不是甜味感受器的介导。

F1,蔗糖的摄食后效应调控索食行为

接下来,研究人员对蔗糖摄食反馈增强索食行为的主要机制进行了研究。之前已经有研究证明饲喂诱导的纹状体中多巴胺释放可以不通过味觉感知而被摄食后反馈来驱动。但是,还没有证明摄食后反馈对多巴胺能神经元活动有直接影响。

为了探讨腹侧被盖区(VTA)多巴胺能神经元对摄食后增强索食行为的是否有潜在影响,研究人员在每日伪随机顺序进行蔗糖或三氯蔗糖胃内灌注,并在同时对自由活动小鼠的VTA多巴胺能神经元活性进行了监测。他们使用深部脑区钙成像技术在4只DATIRES: Cre小鼠中测量了VTA多巴胺神经元活性(图2A,2B)。

使用inscopix公司的nVista微型显微成像设备,可以在小鼠进行摄食行为学实验时及其自由活动期间对其大脑内的神经钙活动信号进行实时观察及记录,整个显微镜埋植在小鼠头骨上,由一根自聚焦透镜深入脑内部,可以对深部脑区纹状体甚至最下面的乳头体进行细致精确的观察。透镜有0.5mm、0.6mm、1mm直径的选择,整个透镜重约2克,小鼠完全可以清醒状态下进行取食及各种自由行为活动。根据调整内部液体透镜的电子对焦,其焦平面变化可变范围达300微米,借助钙指示病毒表达的绿色荧光蛋白可以清晰显示神经元胞体、轴突的脉冲式钙活动,反映神经环路中的具体实时活动。配套的软件可以自动的对活动神经元进行识别统计,集成的算法可视化的对每次活动进行强度和持续时间的统计。

实验中,平均每只动物每天记录19个神经元的活动。在活动神经元数量上,蔗糖组和三氯蔗糖组没有显着差异(图2C)。但相对于三氯蔗糖,胃内输注蔗糖后,活动上调的神经元比例显著增加(图2D),而且这些被蔗糖上调的神经元持续活动时间相对于基线水平更长(图S2B),那些活动下调的神经元未发现活动持续的差异(图S2C)。

在对最后一个蔗糖摄入阶段和随后的三氯蔗糖摄入阶段记录的40个神经元进行分析时,结果得到了证实,相对于三氯蔗糖,神经元对蔗糖的反应明显更大,与三氯蔗糖相比,蔗糖正调的神经元更多。对最后一个蔗糖摄入阶段和前期的三氯蔗糖摄入阶段记录的神经元进行分析时,结果是一致的。在整个实验过程中,在蔗糖和三氯蔗糖摄入时进行的运动测量显示没有差异,表明运动不是两者VTA多巴胺神经活动出现差异的原因。

这些数据表明,蔗糖的摄食后效应足以在VTA多巴胺能神经元中诱导出现持续的活性。


F2,胃内蔗糖递送可以激活VTA多巴胺能神经元

为了测试VTA多巴胺能神经元活动对于摄食后索食是否必要,研究人员制作了NMDA依赖的条件性控制多巴胺能神经元burst活动的小鼠,可诱导其对预期奖励刺激和学习的活动响应降低及神经可塑性的改变。

并制作了Th-Cre小鼠来实现标记细胞类型和分布的特异性,该小鼠主要在VTA的表达酪氨酸羟化酶基因的神经元中表达Cre重组酶。

酪氨酸羟化酶和GFP的双重免疫染色证实Cre重组主要在VTA的多巴胺能神经元中,部分发生在黑质中,在LC中仅是很少量表达。

科学家们正是利用Inscopix nVista,nVoke系例设备,可以满足任何形式的大脑神经元,神经环路研究,对自由状态下的小鼠大脑内如烟花般的神经脉冲电流进行真实准确的记录!

然后将Th-Cre小鼠与携带可剪切NMDA受体NR1亚基的小鼠Grin1-Flox杂交,子代小鼠的TH神经元中具有NR1 缺失(KO),我们将其称为Th-CreNR1KO小鼠。为了验证这些小鼠中特定类型细胞的NMDAR缺失,我们在新鲜脑切片中进行了whole-cell记录,测量电刺激诱发的NMDAR介导兴奋性突触后电流。在Th-CreNR1KO小鼠中,仅在记录的22个VTA多巴胺能细胞中的1个细胞里检测到INMDA,而在对照小鼠中,在所有VTA多巴胺能和LC去甲肾上腺素神经元中都检测到了INMDA(图3C和3D)。与GFP报告基因小鼠的结果一致,在Th-CreNR1KO小鼠中,在记录的32个SNc多巴胺能神经元中有11个神经元检测到了INMDAs,9个LC去甲肾上腺素神经元中有8个检测到了INMDA,这表明LC大部分NMDAR被保留,SNc部分受到影响,但比VTA范围要小。

为了评估清醒和自由移动的小鼠中VTA多巴胺神经元的burst活动,他们在VTA中植入多电极微线阵列,根据测量得到的波形,基础放电速率和对多巴胺D2受体激动剂quinpirole的敏感性反应,记录了被推定为多巴胺能神经元的活动(图3E和3F)。在基线水平时,Th-CreNR1KO小鼠在VTA多巴胺能神经元的burst数量和激发尖峰均较少,说明小鼠被削弱了对奖励预期刺激的反应。然后,他们对ThCreNR1KO小鼠进行如上实验,测定它胃内注入蔗糖后增强索食行为的能力是否受损(图3I)。

如同预期,在对照组中,胃内蔗糖比胃内三氯蔗糖使小鼠产生更多的启动开关行为,而Th-CreNR1KO小鼠对胃内蔗糖和三氯蔗糖两组表现出相似的开关启动行为(图3J)。结果表明依赖于NMDA的burst和多巴胺能VTA神经元的可塑性对于蔗糖摄食后增强开关启动行为是必需的。

F3,VTA多巴胺能神经元活动对于摄食后调控的索食行为是必要的

 

尽管有大量的脑-肠功能轴的证据,但与摄食后营养关联信号引起多巴胺能神经元活动和行为反应的机制尚不清楚。有证据表明迷走神经损伤会破坏风味——营养调控,但其在营养调控中的作用仍存在争议,并且还有激素影响营养物质感应的报道。鉴于先前的研究,肝迷走神经(HVN)有可能担负摄食后营养信息的传导,我们测试了HVN的切断是否影响蔗糖对VTA多巴胺能活性和强化索食的效应。研究人员在3只DAT-IRES:Cre小鼠的HVN处进行神经切断术,另3只接受假手术,进行与前述相同的实验,用深部脑区钙成像观察测量胃内注入蔗糖或三氯蔗糖期间VTA的多巴胺能活性。 HVN神经切断并不影响每只动物每阶段记录的平均神经元数量(图4A)。如预期的那样,实施假手术小鼠在蔗糖组与三氯蔗糖组相比,蔗糖组的VTA多巴胺能活性显着增加(图4B)。 假手术小鼠中,摄取蔗糖鼠的正调神经元比例也更高(图4C)。而在迷走神经切断鼠中,蔗糖和三氯蔗糖摄取鼠的VTA多巴胺能活性以及正调神经元的比例没有差异。跟踪最后一个三氯蔗糖摄食阶段和随后的蔗糖摄食阶段中记录的每个单独神经元(图4F,G),确定了在假手术鼠中,被蔗糖正调的神经元比例相比三氯蔗糖大得多,而在神经切断鼠没有出现同样结果,导致蔗糖正调的神经元在切断组和假手术组有显著不同(57%对32%;图4H)。对于神经切断组,即使目视检查单细胞多巴胺能活性表明蔗糖的作用持续时间更长(图4G),但直接测量比较这些神经元在蔗糖和三氯蔗糖摄食期的活性,却并没有显示出显著的增强剂作用。但是它揭示了一个显著的时间——增强剂相互作用,这可能反映了胃内蔗糖的不依赖HVN的残留的效应。

最后,我们在另一组C57Bl6/J小鼠中执行了上述的摄食后行为强化实验(图4I),发现与假手术小鼠相比,HVN切除小鼠对摄食后蔗糖的有明显更少但没有完全消失的开关控制行为(图4J)。

这些结果证实,通过迷走神经肝分支的信号传导在VTA多巴胺能活性和索食行为的摄食后调控中具有关键作用。

F4,索食和多巴胺神经元活性的摄食后增强受迷走神经肝分支的控制




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